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GELOSE AU SANG FRAIS ANC
(Acide Nalidixique Colistine)
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Milieu riche sélectif pour l’isolement des streptocoques
et autres bactéries à Gram positif

COMPOSITION: en grammes par litre d'eau distillée

Mélange spécial de peptones.........23
Amidon…………………………..1
NaCl…….......................................5                                     
Agar…….......................................10
Sang de mouton…………………50 mL
Acide nalidixique………………..0,015
Colistine………………………….0,015
                               pH final = 7,3

 

NB: base Columbia dans cette composition, mais possibilité d’utiliser aussi une GTS ou un MH ou une base sang (milieux non glucosés, isotoniques).

 

PREPARATION
1. Liquéfier la base contenant les antibiotiques au bain-marie bouillant.
2. Attendre son refroidissement à 45°C (milieu en surfusion).
3.Y ajouter stérilement, à l'aide d'une pipette Pasteur (1 goutte = 0,05 mL), la quantité de sang nécessaire pour obtenir une concentration finale en sang de 5%, soit:

  • Pour 7 mL de milieu de base (petit culot): (7 x 0,05) / 0,05 = 7 gouttes
  • Pour 18 mL de milieu de base (grand culot): (18 x 0,05) / 0,05 = 18 gouttes

F Le sang ne doit pas être sorti au dernier moment du réfrigérateur, sinon il y a prise en masse du milieu au moment de l'addition du sang.
4. Homogénéiser en faisant rouler le tube entre les mains, en évitant la formation de bulles.
5. Couler en boîte de Pétri en évitant la formation de bulles.

Autre possibilité: le sang frais peut être placé directement dans la boîte de Pétri. On coule ensuite le milieu en surfusion et on homogénéise dans la boîte de Pétri.

 

PRINCIPE, INTERET

  • Milieu riche qui permet la culture et l’isolement des bactéries exigeantes.
  • L’acide nalidixique et la colistine sont des antibiotiques qui inhibent les bactéries à Gram négatif.
  • La lecture de l’hémolyse est un critère d’orientation pour les streptocoques.

 

LECTURE
Après 24 à 48 heures d’incubation à 37°C en aérobiose (éventuellement atmosphère enrichie en CO2) :

  • Examen macroscopique des colonies
  • Lecture de l’hémolyse :
    • Absence d'halo d'éclaircissement autour de la colonie: absence d'hémolyse
    • Halo d'éclaircissement complet, à bords nets: hémolyse ß (lyse des hématies et digestion totale de l’hémoglobine libérée)
    • Halo flou d'éclaircissement (sans verdissement): hémolyse ß' ou hémolyse "ß floue"
    • Halo verdâtre, à bords flous: hémolyse a (lyse des hématies et digestion incomplète de l’hémoglobine libérée a methémoglobine).

 

 

 

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Par Brigitte VERON - Collectif Photo-Reims